《Établissement d'un Micropterus Salmoides Rhabnovirus Detection Méthode basée sur CRISPR CAS13A System Express
Zhang Minlin, Huang Fengqi, Zuo Xiaoling, Liang Jiantao, Liang Kaishan, Dan Jinhong, Li Zongyang, Yu Jie, Luo Liyuan, Xie Zijie, Zhao Huihong, Wang Qing Création d'une méthode de détection pour la grande bouche Bass Bass Flavivirus basée sur Crispr / Cas13. Journal chinois d'hydrobiologie, 2024, 48 (2): 283-291. Doi: 10.7541 / 2023.2023.0199
Micropterus salmoides, également connu sous le nom de basse de Californie ou de bar noir américain, est un poisson d'eau douce originaire d'Amérique du Nord. Ces dernières années, il est devenu un poisson d'élevage important dans le monde entier en raison de sa forte demande de marché: Micropterus Salmoides a une viande ferme, peu d'os, un goût délicieux, une nutrition riche, en particulier des protéines riches en gras et de faibles gras, qui répond à la demande des consommateurs pour des aliments sains. Par conséquent, le prix du marché est relativement élevé et il est souvent utilisé sur le marché de la restauration haut de gamme. Croissance rapide: Micropterus salmoides croît rapidement et peut généralement atteindre des spécifications de produits en 6-8. Il convient à l'élevage de courts-cycle et peut rapidement réaliser les rendements des investissements. Fort résistance aux maladies: par rapport à d'autres poissons d'élevage, Micropterus salmoides a une forte adaptabilité à l'environnement, des épidémies de maladies moins à grande échelle et réduit les risques de reproduction. Élevage écologique: l'achigan à grande bouche peut être mélangé à d'autres poissons d'eau douce tels que la carpe argentée et la carpe d'herbe, ce qui aide à atteindre l'équilibre écologique de l'étang et à maximiser l'utilisation des ressources, à améliorer encore l'efficacité de l'élevage et d'autres facteurs. Il est accueilli par les convives et les agriculteurs de l'aquaculture, et son échelle de reproduction a augmenté rapidement ces dernières années.
Bien que Micropterus salmoides soit relativement résistant aux maladies, ils peuvent encore souffrir de certaines maladies dans de mauvaises conditions de reproduction. Parmi eux, le Micropterus salmoides rhabdovirus (MSRV) est extrêmement nocif: il a été découvert pour la première fois en Floride, aux États-Unis, en 1991. Le virus a été initialement détecté dans les populations de basse à grande bouche sauvage, puis s'est propagée progressivement à de nombreux lacs et réservoirs d'eau douce aux États-Unis, devenant l'un des principaux agents pathogènes de la grande basse.
Symptômes cliniques des poissons malades
R: Bass à grande bouche sain, la flèche indique le sac jaune; B: Bass à grande bouche malade, la flèche indique le sac jaune.
La source de transmission est souvent infectée par les alevins ou les poissons adultes, les plans d'eau pollués et les poissons sauvages portant le virus; Ce virus peut être transmis par contact direct, excrétion fécale et dans les plans d'eau, et est plus susceptible de se produire dans une mauvaise qualité de l'eau ou des conditions de reproduction à haute densité. diffusion. Le virus peut provoquer la léthargie, l'errance, le gonflement abdominal et la distorsion corporelle chez les poissons juvéniles, ainsi que pour induire des ulcères nécrotiques et des saignements multi-organes. Une fois infectée, le taux de mortalité dépasse 90%.
Symptômes cliniques de Micropterus Salmoides infectés artificiellement
R: Bass à grande bouche sain; B, C, D: Bass à grande bouche infecté artificiellement.
Chaque année, plus de 30% de Micropterus Salmoides Fry est perdu en raison de MSRV. Actuellement, les méthodes de traitement et de détection du virus sont encore immatures et il n'y a pas de médicament spécifique pour le traiter. Par conséquent, il est très nécessaire de détecter le virus dans le temps avant l'infection et de prendre des mesures préventives efficaces, ce qui peut réduire les pertes du processus de reproduction dans une certaine mesure;
De plus, il est difficile de réaliser une détection sur place sans équipement de détection complexe avec une technologie de détection existante. Face à ce défi, l'équipe de recherche de la South China Agricultural University a développé une nouvelle méthode de détection combinant MIRA avec CRISPR-System. Cette méthode a une forte spécificité, une sensibilité élevée et un fonctionnement simple, ce qui améliore considérablement l'efficacité de détection du MSRV et aide également à détecter le MSRV le plus tôt possible et à prendre des mesures de prévention et de contrôle.
Mira Primer Combination Criening
Deux paires d'amorces Mira différentes ont été utilisées pour amplifier le fragment de gène contenant la séquence cible, et les produits amplifiés ont été soumis à une électrophorèse sur gel d'agarose. Le graphique d'électrophorèse était situé à la position de 100 pb, et des bandes lumineuses sont apparues dans les trois voies, ce qui indique qu'il y avait des produits d'amplification non spécifiques. Les bandes cibles amplifiées à 250 pb dans les voies 2 et 3 ont été respectivement analysées quantitativement par le logiciel Image J, et les résultats de l'analyse quantitative ont été exprimés par "valeur gris". D'après les résultats de l'analyse, on peut conclure que plus la valeur gris est faible, plus le taux d'utilisation de l'amorce est élevé, c'est-à-dire, plus l'efficacité d'amplification de liaison spécifique à l'amorce est élevée.
Les résultats ont montré que l'efficacité d'amplification de liaison spécifique était élevée lorsque la paire d'amorces Mira-F2 / R2 a été utilisée.
Électrophorèse Mira Primer Paire Electrophorèse Gel Image et analyse de la valeur de gris
un. Marker ADN de la voie de l'électrophorèse M: 2000 pb; Piste d'électrophorèse 1. Amplification négative de l'échantillon d'ADN; La piste d'électrophorèse 2. La paire d'amorces Mira-F1 / R1 amplifie le fragment cible (224 pb comme indiqué dans la boîte); électrophorèse Lane 3. La paire d'amorces Mira-F2 / R2 amplifie le fragment cible (255 pb comme indiqué dans la boîte); né Analyse de la valeur gris de la bande (comme indiqué dans la boîte)
Système de détection CRISPR / CAS13A
Une fois la réaction du système de détection CRISPR / CAS13A terminé, il est irradié avec une lumière ultraviolette pour observer les résultats.
Système de détection CRISPR / CAS13A Diagramme de luminosité
1-3. L'ensemble du système avec la norme d'ARN a ajouté; 4. Aucun CRRNA ajouté; 5. Aucune protéine CAS13A ajoutée; 6. Aucune sonde de rapporteur d'ARNdb ajoutée; 7. Contrôle négatif
CRISPR / CAS13A-MSRV Système de réaction optimale
Nous avons mené des expériences en utilisant des étalons d'ARN et l'ARN de l'échantillon amplifié. La vitesse de positionnement de l'ARN cible était meilleure avec CRRNA2 qu'avec CRRNA1. CRRNA1 avait un signal de fluorescence final plus fort que CRRNA2. L'utilisation mixte de CRRNA 1+ CRRNA2 dans des proportions égales pourrait combiner les avantages des deux et obtenir une meilleure efficacité de réaction.
Optimisation des conditions de réaction de détection CRISPR / CAS13A-MSRV et résultats de détection
un. Comparaison des résultats de détection de l'ARN standard en utilisant du CRRNA avec différentes séquences d'espaceur;
né Comparaison des données du signal de fluorescence de l'ARN standard détecté par le système de détection à différentes températures;
c. Comparaison des données du signal de fluorescence de l'ARN standard détecté à l'aide de sondes de rapporteur d'ARN avec différentes concentrations;
d. Comparaison des résultats de détection de l'ARN standard détecté en utilisant des complexes de sonde Cas13A / CRRNA avec différents rapports de concentration;
Pour explorer l'effet de la température de réaction sur le système de détection, différentes températures de réaction de 31 degrés, 34 degrés, 37 degrés et 41 degrés ont été fixées. La température de réaction optimale du système de détection CRISPR / CAS13A-MSRV était de 37 degrés.
Pour explorer l'effet de la concentration de sonde sur le rapporteur de l'ARNdb sur le système de détection, dans la plage de test, l'intensité de fluorescence était positivement corrélée avec la concentration de sonde rapporteur de SSRNA. L'effet de détection de la concentration de sonde sur le rapporteur SSRNA n'était pas très différent à 500-700 nmol / l. Compte tenu des problèmes économiques réels, la concentration optimale de sonde sur le rapporteur de l'ARNdb était de 500 nmol / L.
Pour explorer l'effet de différents rapports de concentration de réaction CAS13A et CRRNA sur le système de détection, lorsque le rapport de Cas13a: CRRNA était de 4: 1 et 3: 1 sur la base du rapport de 100 nmol / L par portion, Cas13a a atteint la saturation; Lorsque la quantité de CAS13A était constante, l'intensité du signal de fluorescence n'était pas positivement corrélée avec l'augmentation de la quantité d'ARNr. Par conséquent, lorsque le rapport de CAS13A / CRRNA est de 2: 1, le système de détection CRISPR / CAS13A-MSRV peut atteindre une activité de détection maximale.
Évaluation de la sensibilité
Afin d'explorer la concentration de détection minimale de MSRV par le système de détection CRISPR / CAS13A-MSRV, la norme d'ARN a été diluée 10 fois dans une série et détectée par le système de détection CRISPR / CAS13A-MSRV. Le système de détection CRISPR / CAS13A-MSRV peut détecter au moins 100FM d'ARN cible MSRV. Lorsque la concentration d'ARN cible est inférieure à 100FM, le signal de fluorescence détecté par la machine n'est pas significativement différent de celui du contrôle vide. Par conséquent, le système de détection CRISPR / CAS13A-MSRV peut détecter au moins 100FM d'ARNdb MSRV.
Évaluation de la spécificité du système de détection CRISPR / CAS13A-MSRV pour MSRV
Tests d'échantillons
Pour les échantillons de poissons malades avec des signes évidents de maladie collectés dans les fermes de basse maritime, nous avons vérifié si l'agent pathogène infecté par les poissons malades était le MSRV. Nous avons utilisé des amorces spécifiques à la séquence de protéines de capside MSRV pour l'amplification de la PCR, et envoyé les bandes correspondantes dans le diagramme d'électrophorèse pour les tests. Après comparaison, nous avons confirmé que c'était MSRV.
Confirmation des informations de séquence MSRV
un. Amplification PCR de 228 BP Band de produits d'amorces MSRV; né La séquence de protéines de capside MSRV par rapport au NCBI, les séquences BOLD sont des sites de liaison en amont et en aval, et les zones ombrées sont des emplacements cibles pour la liaison CRISPR / CAS13A-MSRV CRRNA1
Les échantillons de poissons malades infectés par la MSRV ont été prétraités et préamplifiés pour l'ARN viral, puis testés avec le groupe témoin négatif. Dans le même temps, l'ADNc des échantillons a été extrait pour comparaison avec le qPCR conventionnel. Les échantillons positifs (n ° 3, 6, 7, 8, 9, 12, 13, 14 et 15) détectés par le système de détection CRISPR / CAS13A-MSRV étaient les mêmes que les résultats du qPCR conventionnel, où la valeur CQ de qPCR était comprise entre 18 et 25; Alors que le nombre de cycles de seuil d'échantillons négatifs (n ° 1, 2, 4, 5, 9, 10 et 11) était supérieur à 38, ce qui indique que les échantillons ne portaient pas de virus MSVR. En résumé, les données de détection du système de détection CRISPR / CAS13A-MSRV et du RT-QPCR conventionnel étaient cohérentes, ce qui indique que le système de détection CRISPR / CAS13A-MSRV est possible et peut remplacer les méthodes de détection conventionnelles et compliquées d'origine dans une certaine mesure.
Tableau de comparaison vertical de l'échantillon de données de détection QPCR avec qPCR et CRISPR
un. Détection qPCR du diagramme de numéro de cycle d'échantillon clinique de MSRV; Le numéro de cycle d'échantillon détecté a été comparé au numéro de cycle de référence négatif à l'aide de l'analyse des tests t (** P<0.01);
né CAS13A combiné avec la détection MIRA du diagramme de fluorescence clinique MSRV; La valeur de fluorescence d'échantillon détectée a été comparée à la valeur de fluorescence de référence négative en utilisant l'analyse des tests t (** P<0.01)
En résumé, la méthode de détection CRISPR / CAS13A-MSRV établie dans cette étude ne nécessite pas d'instruments expérimentaux coûteux, ce qui rend la détection sur place rapidement, précise et pratique. Par conséquent, si cette méthode de détection est utilisée pour découvrir en temps opportun le MSRV dans le processus de reproduction réel et prendre des mesures ciblées et efficaces, elle peut considérablement réduire les pertes causées par les maladies dans le processus de reproduction. De plus, cette méthode de détection est rapide, très sensible et spécifique, et a d'excellentes perspectives d'application et de promotion.