《Développement d'un nouveau CAS13A / CAS12ADual "un pot" test de détection pour les cultures génétiquement modifiées
Les cultures génétiquement modifiées ont été largement plantées dans le monde, et de nombreux pays ont progressivement amélioré leurs mesures réglementaires pour assurer la sécurité des cultures génétiquement modifiées. Le développement de méthodes de détection génétique sur place rapide et précise est très importante pour l'agriculture et la biosécurité, et peut atténuer les préoccupations publiques concernant les produits génétiquement modifiés.
Dans cette étude, le groupe de recherche a développé une nouvelle réaction en un pot -- Mira Dual Detection combinée à la double CRISPR (méthode MR-DCA) pour la détection simultanée de CAMV35S et des cibles génétiques NOS dans des cultures génétiquement modifiées, fournissant une méthode de détection simple et efficace pour la détection de cultures génétiquement modifiées.
Méthodes expérimentales
Le produit Mira Dual est analysé par le système double CAS13A et CAS12A pour générer deux signaux indépendants qui n'interfèrent pas les uns avec les autres, puis la couleur fluorescente est lue par un instrument d'éclairage ou par une bande de test avec deux lignes T pour obtenir une lecture à deux canaux. L'ensemble du processus est achevé en moins de 35 minutes, avec une limite de détection aussi faible que 20 copies.
(Principe de la détection MR-DCA de CAMV35S et NOS)
L'expérience entière est divisée en trois étapes: l'amplification Mira, la réaction CRISPR et deux méthodes d'interprétation des résultats.
Le gène CAMV35S est utilisé comme cible de CAS13A, et le gène NOS est utilisé comme cible de CAS12A. Deux paires d'amorces Mira ont été conçues respectivement. Le système CAS13A ne reconnaît que l'ARN, de sorte que la région d'amorce avant est conçue, qui contient un promoteur T7 pour la transcription et l'activation ultérieures de CAS13A. Un PAM est ajouté au gène NOS. Les ajouts ci-dessus garantissent que les protéines CAS13A et CAS12A peuvent se lier à leurs CRRNA respectifs, et il n'y a pas d'interférence ou de réaction croisée entre les deux systèmes.
Situation expérimentale
Sensibilité et spécificité
L'échantillon a été dilué dans un gradient pour tester l'intensité de fluorescence de la réaction MIRA. Il a été constaté que l'intensité de fluorescence pouvait encore être détectée à une concentration d'échantillon de 20 μl. La concentration de 20 μL a finalement été sélectionnée pour l'expérience.
(Différentes concentrations d'échantillons et bandes de test sont utilisées pour le développement des couleurs et le calcul de la quantification de l'intensité)
Pour évaluer davantage la spécificité du MR-DCA, l'équipe de recherche a testé des échantillons mixtes d'animaux non transgéniques et de plantes non transgéniques. Les résultats ont montré que seuls les échantillons transgéniques contenant des CAMV35 et NOS avaient des signaux de fluorescence élevés, tandis que l'intensité de fluorescence d'autres échantillons était proche de celle du contrôle négatif. Le MR-DCA peut être utilisé comme plate-forme de détection spécifique à double cible d'acide nucléique.
24 échantillons de cultures ont été testés par MR-DCA. Parmi eux, 1, 2, 15, 16, 21 et 22 sont le promoteur transgénique contenant du maïs CAMV35S. 7, 8, 23 et 24 sont du riz transgénique résistant aux maladies contenant du terminateur NOS. 3, 4, 11, 12, 13, 14, 17 et 18 sont du soja transgénique contenant le promoteur CAMV35S et le terminateur nos.
(Résultats de test de 24 échantillons)
Réaction rapide
Le temps de réaction est un facteur important dans la détection sur place. L'équipe de recherche a observé que les signaux de fluorescence de FAM et Hex pouvaient être détectés par un instrument de fluorescence lorsque le temps de réaction était de 10 minutes. Mira combinée à la réaction CRISPR a également observé la fluorescence jaune après 15 minutes.
(Signal de fluorescence à différents temps de réaction Mira)
(Le développement des couleurs des bandes de test à différents temps de réaction MIRA et le calcul de la quantification de l'intensité)
Conclusion expérimentale
Les résultats expérimentaux ont montré que le double mira a une bonne spécificité et peut obtenir avec précision les produits d'amplification de CAMV35S et NOS. Les systèmes CAS13A et CAS12A réagissent indépendamment sans interférer les uns avec les autres. Le test MR-DCA peut détecter avec précision 20 exemplaires à une faible température de 35 minutes, ce qui a une grande valeur à détecter les cultures génétiquement modifiées sur le terrain.
Informations sur l'article
Nom du journal: 《Journal of Advanced Research Express
Titre de l'article: 《Développement d'un nouveau test de détection à double détection médié par CAS13A / CAS12A pour les cultures génétiquement modifiées Express
Facteur d'impact: 11.4
Équipe de recherche: Wang Xiaofu, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences