Aeromonas hydrophila est une bactérie pathogène importante en aquaculture, provoquant de graves maladies chez les animaux d'élevage et entraînant des pertes économiques substantielles. Pour permettre une détection rapide sur-site, nous avons développé une plate-forme microfluidique portable qui intègre une amplification rapide isotherme multi-enzymatique (MIRA) avec une manipulation automatisée des fluides. La conception de la puce incorporait un moteur vibrant miniature et des coussinets chauffants en céramique pour maintenir
contrôle précis de la température et assurer l’homogénéité de la réaction tout au long de l’extraction et de l’amplification des acides nucléiques. Une pompe à air miniature a fait passer l'extrait brut d'ADN à travers la puce en une seule étape de pipetage pour un résultat précis.quantification. L'ADN extrait a ensuite été transféré dans une chambre de réaction préchargée avec MIRA.réactifs pour l'amplification isotherme à 39 degrés sous surveillance de fluorescence en temps réel-. Cette plateforme a détecté
A. hydrophila dans les échantillons d'eau dans les 40 minutes, atteignant une plage linéaire de 1 × 10² à 1 × 10⁷ CFU⋅mL−1et une limite de détection (LOD) de 10 CFU⋅mL−1. Notamment, sa conception modulaire permet un échange facile des amorces et des sondes, ce qui rend la plateforme facilement adaptable à la détection de divers pathogènes bactériens en aquaculture.
Comparaison schématique de la plateforme microfluidique portable et de la plateforme de détection conventionnelle pour A. hydrophila. (A) Le microfluidique portable
plate-forme. Le flux de travail de détection sur cette plate-forme intègre l'extraction d'acide nucléique, le pipetage précis, l'amplification et la détection. (B) La plate-forme de détection conventionnelle. Le flux de travail conventionnel-basé sur un laboratoire repose sur des équipements sophistiqués, un personnel formé et des procédures-qui prennent beaucoup de temps.
Évaluation de la stabilité de la plateforme microfluidique portable. (A) Photographie de la plate-forme microfluidique portable. (B, C) Performance thermique des chambres d’extraction et de détection d’acide nucléique. Relation entre le coussin chauffant en céramique et la température de la chambre. (D) Stabilité de détection de fluorescence (N=3). L'intensité de la fluorescence a été mesurée à intervalles de 5 minutes tout au long du processus d'amplification.
Évaluation des performances de la plateforme microfluidique portable. (A) Courbe d’étalonnage pour la détection d’A. hydrophila (N=3). Une courbe d'étalonnage a été établie en détectant A. hydrophila sur une plage de concentrations de 1 × 101 –1 × 108 CFU⋅mL−1dans des conditions optimales. (B) Évaluation de la reproductibilité d'une puce-à-puce. Le test MIRA pour A. hydrophila a été réalisé sur dix puces fabriquées à partir de chacun de deux moules indépendants. (C) Analyse de spécificité (N=3). La spécificité du test MIRA a été validée par rapport à la cible A. hydrophila et à 11 espèces bactériennes non-cibles. (D) Comparaison avec qPCR (N=3). La plateforme et la qPCR ont été utilisées pour détecter A. hydrophila à diverses concentrations. (E) Détection de souches isolées sur le terrain - (N=3). Quatre souches isolées sur le terrain d'A. hydrophila ont été détectées à l'aide de la plateforme et de la qPCR.