L'article propose une nouvelle technologie de puce microfluidique pour la détection multiplex des micro-organismes pathogènes des crevettes. L'équipe de recherche a intégré la technologie multi-enzyme multi-enzyme de la technologie d'acidiation nucléique rapide (MIRA) et les méthodes de détection de fluorescence en temps réel. Cette puce microfluidique fournit une solution rapide, sensible et efficace pour la détection sur place des principaux agents pathogènes de crevettes.
Contexte de recherche et signification
L'industrie mondiale de la crevette est l'une des composantes économiques les plus importantes de l'aquaculture, mais l'industrie fait longtemps face aux menaces de divers micro-organismes pathogènes. Ces agents pathogènes entraînent souvent une mort à grande échelle de crevettes, affectant sérieusement la production et les avantages économiques. Y compris la maladie aiguë de la nécrose hépatopancréatique (AHPND), le virus du syndrome de la tache blanche (WSSV), le virus infectieux hypodermique et l'hématopoïétique de nécrose (IHHNV), l'hémocyte des crevettes (SHIV), et l'enterohepaticus (EHP), etc. Les virus, les bactes et les parasites posent la crevette.
Les méthodes traditionnelles de détection des agents pathogènes, telles que la réaction en chaîne par polymérase (technologie PCR), ont une sensibilité et une spécificité élevées, mais sont complexes à fonctionner, prennent beaucoup de temps et comptent sur des équipements de laboratoire. Ces limitations rendent la technologie PCR inadaptée aux tests rapides sur place. La technologie Mira est devenue un outil de détection moléculaire adapté à l'application sur place en raison de ses caractéristiques d'amplification rapide à température constante et à la température normale.
Principe de la technologie Mira
La technologie multi-enzyme à température constante d'acide nucléique à température rapide (technologie Mira) est une technologie d'amplification à température constante qui repose sur la synergie de multiples protéines fonctionnelles à température ambiante pour atteindre une amplification rapide des acides nucléiques. Il s'agit d'une technologie de détection d'acide nucléique rapide véritablement portable. Par rapport à la PCR, Mira a plus d'avantages.
Conception et innovation des puces microfluidiques
Diagramme schématique de la plate-forme de détection RPA sur Chip pour plusieurs micro-organismes pathogènes importants
(A) Structure d'une puce microfluidique de type disque. 1: chambre de réaction; 2: valve à billes; 3: Port d'échappement; 4: port d'échantillonnage;
(B) Vue explosée. 5: Film de scellage de chaleur; 6: substrat de puce.
(C) Disposition détaillée des six ensembles d'amorces dans le secteur. Chaque ensemble d'amorces est pré-fixe dans une chambre de réaction désignée.
(D) Procédure de fonctionnement complète sur la plate-forme de détection RPA de puce.
L'article propose une puce microfluidique intégrée à la technologie Mira pour la détection multiplex des micro-organismes pathogènes des crevettes. La technologie microfluidique peut contrôler les liquides dans les canaux de niveau micron pour une manipulation précise, atteignant ainsi une détection efficace et multi-cibles à faible coût.
La puce a les caractéristiques de conception des clés suivantes:
● puce microfluidique centrifuge
La puce adopte une conception d'entraînement centrifuge, en utilisant la force centrifuge pour répartir uniformément l'échantillon dans chaque chambre de réaction. Cette conception simplifie le processus de fonctionnement et l'opérateur peut terminer toute la réaction en injectant simplement l'échantillon.
● Détection multi-cible
La puce est pré-incorporée avec les types bactériens qui doivent être détectés: nécrose hépatopancréatique aiguë (V-AHPND), virus du syndrome de la tache blanche (WSSV), virus infectieux sous-cutané de nécrose (IHHNV), Hemocyte iridovirus (Shiv) et entérohépatite hepatite (ehp). ) Sondes d'amorce pour cinq agents pathogènes. Cette conception peut détecter simultanément six cibles de gènes dans une réaction, permettant un dépistage rapide de plusieurs agents pathogènes.
● Détection de fluorescence en temps réel
La réaction d'amplification de la technologie MIRA dans la puce est combinée avec une sonde fluorescente, qui peut surveiller la progression de la réaction d'amplification en temps réel. La conception de la sonde permet de libérer le signal fluorescent uniquement lorsque le produit d'amplification est généré, atteignant ainsi une détection quantitative rapide et sensible.
● Système de réaction à faible concentration
Chaque unité de réaction de la puce ne nécessite qu'un volume de réaction de 5 μL, ce qui réduit considérablement la consommation de réactifs. Lorsque l'ensemble du système est en cours d'exécution, jusqu'à quatre échantillons peuvent être traités simultanément, et chaque échantillon peut détecter cinq agents pathogènes, améliorant considérablement l'efficacité de détection.
Sensibilité, spécificité et répétabilité
Les performances du système de puces comprennent la détection de la symétrie, de la résonance et de la répétabilité.
● Sensibilité
Les résultats expérimentaux montrent que la puce peut détecter les nombres de copie des gènes cibles aussi faibles que 10 copies / μl, avec une sensibilité comparable ou même plus élevée que les méthodes de PCR traditionnelles. Cette sensibilité élevée garantit que la technologie peut détecter les individus infectés tôt dans des applications pratiques, permettant ainsi un dépistage précoce des agents pathogènes.
● Spécificité
L'expérience a effectué des tests de réaction croisée sur une variété d'agents pathogènes non cibles, et les résultats ont montré que la puce est très spécifique aux agents pathogènes cibles et peut distinguer avec précision divers types d'agents pathogènes. Tous les tests de maladie de nécrose hépatopancréatique aiguë (V-AHPND), de virus du syndrome de Spot White (WSSV), de virus infectieux hypodermique et hématopoïétique de nécrose (IHHNV), de virus iridescence hémacytique (SHIV) et d'entérohepatite, peuvent indiquer efficacement la méthode (EHP). amplification non spécifique.
● répétabilité
Afin d'évaluer la stabilité de la méthode, l'équipe de recherche a mené plusieurs expériences répétées. Les résultats ont montré que le coefficient de variation (valeur CV) entre différentes expériences était inférieur à 10%, montrant une bonne répétabilité expérimentale et une cohérence.
Applications et avantages sur le terrain
La conception de la puce microfluidique de la technologie Mira lui offre des avantages importants d'application sur le terrain, en particulier adaptés à la détection rapide et à la surveillance des agents pathogènes dans la culture des crevettes:
● Processus de fonctionnement pratique
L'ensemble du processus de détection nécessite uniquement l'injection de l'échantillon dans la puce et le démarrage du dispositif de réaction. Il ne nécessite presque aucune opération manuelle et convient aux non-professionnels à utiliser sur le site.
● Capacité de réponse rapide
Le système peut obtenir les résultats des tests dans les 20 minutes, raccourcissant considérablement le temps de test. Ceci est crucial pour la réponse rapide des maladies dans les fermes et la réduction de la propagation des agents pathogènes.
● Capacité de détection multiplex
Cinq pathogènes majeurs peuvent être identifiés dans un test, ce qui améliore considérablement l'efficacité de détection et permet d'économiser les coûts et le temps de détection.
Perspectives technologiques Mira
Bien que la technologie de PCR ait longtemps été évaluée comme l'étalon-or pour la détection d'amplification de l'acide nucléique, la technologie Mira a démontré un grand potentiel d'application en raison de sa réaction rapide à température constante, un fonctionnement simple et de faibles exigences d'équipement. En comparant avec la PCR combinée au séquençage d'ADN, il a été constaté que les résultats de détection de la puce d'amplification isotherme sont cohérents avec les résultats de la PCR en termes de sensibilité et de spécificité, et le temps de réaction de la technologie Mira est significativement raccourci. Par conséquent, les puces microfluidiques de la technologie Mira sont considérées comme une technologie plus adaptée aux applications sur le terrain, en particulier dans les environnements qui nécessitent une détection rapide et à grande échelle des agents pathogènes.
Les puces microfluidiques basées sur la technologie multi-enzyme d'amplification par acide nucléique (MIRA) multi-enzymatique fournissent un outil efficace pour la détection de micro-organismes pathogènes dans l'agriculture des crevettes. Cette technologie présente les avantages d'une sensibilité élevée, d'une bonne spécificité, d'un fonctionnement facile et d'une vitesse de détection rapide, et a de larges perspectives d'application dans la prévention et le contrôle des maladies de l'aquaculture. Avec un développement et une optimisation supplémentaires de la technologie, le système devrait être appliqué à la détection d'agents pathogènes plus aquatiques, permettant une prévention et une surveillance plus larges des maladies.
Les résultats de la recherche fournissent une méthode de détection précoce fiable pour l'industrie de l'aquaculture, qui peut réduire efficacement le risque d'épidémies de maladies, améliorer l'efficacité de la production et la production des fermes et jeter une base technique pour le développement durable de l'industrie de l'aquaculture.