Les technologies de diagnostic moléculaire évoluent aujourd'hui à un rythme sans précédent, avec des progrès importants au cours des deux dernières années. Parmi eux, les technologies d'amplification isotherme ont attiré plus d'attention en raison de leur capacité à effectuer une amplification sans avoir besoin d'équipements spécialisés. Il existe plusieurs méthodes d'amplification isotherme bien connues, telles que LAMP, RPA et RAA. Cependant, aujourd'hui, je souhaite introduire une nouvelle technologie d'amplification isotherme-mira.
Pour s'assurer que tout le monde a une compréhension cohérente des concepts clés, voici quelques explications à terme:
- Amplification de la recombinase polymérase (RPA): Il s'agit d'une technologie d'amplification médiée par la recombinase.
- Amplification d'aide à la recombinase (RAA): une méthode d'amplification médiée par la recombinase similaire.
- Amplification isotherme médiée par la boucle (lampe): une autre technique d'amplification isotherme.
- Multianzyme Isothermal Rapid Amplification (MIRA): une nouvelle technologie d'amplification rapide isotherme.
Résumé rapide et clarification:
Beaucoup pourraient se demander laquelle de ces différentes méthodes d'amplification isotherme est plus fiable et stable. En réalité, chaque technologie a ses forces et ses limites. Cependant, les facteurs clés pour une adoption réussie sont la capacité d'évoluer de manière fiable, de faible coût et de performances robustes entre diverses applications.
Je vais maintenant analyser brièvement chaque technologie en fonction de ce que je sais:
Lampe (amplification isotherme médiée par la boucle):
Beaucoup dans le domaine savent que lampe est originaire du Japon, développée par le Dr Notomi en 2000 en tant que nouvelle technique d'amplification des gènes. Actuellement, la propriété de cette technologie appartient à la société japonaise Eiken Chemical Co., Ltd.
Avantages:
- Sensibilité élevée (2-5 Ordres de grandeur supérieure à celle des méthodes de PCR traditionnelles).
- Temps de réaction court (les réactions peuvent être effectuées en 30-60}).
- Pas besoin d'instruments spéciaux à usage clinique (bien qu'un turbidimètre en temps réel soit recommandé pendant le développement des kits).
- Facile à utiliser (que ce soit de la détection de l'ADN ou de l'ARN, le processus implique de mélanger la solution de réaction, les enzymes et la matrice dans un tube de réaction, puis incubant à environ 63 degrés pendant 30-60 dans un bain d'eau ou un incubateur, avec des résultats observables par l'œil nu).
Inconvénients:
- Une sensibilité élevée peut entraîner une contamination des aérosols une fois le tube ouvert, ce qui le rend inapproprié en dehors d'un laboratoire de PCR en raison d'un risque élevé de faux positifs.
- La conception des amorces est difficile, ce qui le rend inapproprié pour certaines maladies, en particulier celles causées par des virus avec peu de séquences courantes.
- Son application est relativement limitée.
Technologies d'amplification isotherme RPA et RAA:
Ces deux méthodes sont largement homologues, la principale différence étant la source de la recombinase utilisée.
- La recombinase de RPA provient du bactériophage T4.
- La recombinase de Raa est dérivée des bactéries ou des champignons.
Points clés du principe de travail:
1. En présence d'ATP, la recombinase se lie aux amorces, formant un complexe d'acide protéine-nucléique, qui recherche ensuite l'ADN cible correspondant.
2. Une fois que l'amorce trouve le modèle d'ADN correspondant, l'hydrolyse ATP fournit l'énergie pour la recombinase pour quitter l'amorce, et l'ADN polymérase synthétise un nouveau brin d'ADN.
3. En même temps, les protéines de liaison à l'ADN simple brin (SSB) se lient au brin d'ADN déplacé pour empêcher la réforme du double brin.
Avantages:
- La réaction RPA / RAA est très rapide, avec des résultats réalisables en environ 30 minutes.
- La sensibilité peut atteindre 10 copies / μl.
- Pas besoin d'équipement complexe pendant l'amplification.
- Le développement ultérieur de méthodes de chromatographie en or à base de sonde ou colloïdale simplifie considérablement l'interprétation des résultats, ce qui les rend bien adaptés à une utilisation dans les zones limitées ou économiquement défavorisées.
Inconvénients:
- RPA est une technologie développée par la société britannique TwistDX, qui appartient maintenant à Abbott, entraînant des coûts élevés, des cycles d'approvisionnement longs et un manque de soutien technique. Cela rend les applications à grande échelle et la production de masse en Chine.
- RAA est une technologie purement nationale, mais elle manque de stabilité en termes de résistance aux interférences et de cohérence des réactifs du produit. De plus, le processus de fabrication des enzymes fonctionnelles doit être améliorée. Bien que la technologie soit sur le marché depuis cinq ans, elle n'a pas encore été largement adoptée en raison de problèmes de stabilité et de polyvalence.
- RPA et RAA nécessitent des amorces qui sont 30-35 BP en longueur. Les amorces plus courtes affectent la spécificité, la sensibilité et la vitesse d'amplification, ce qui rend la conception des amorces difficile.
Mira (amplification rapide isotherme multitienzyme):
Mira est une nouvelle technologie d'amplification isotherme introduite au milieu -2019. Il est homologue à RPA et RAA.
Bien que Mira partage des similitudes avec RPA et RAA en termes de principes de travail, il existe des différences significatives dans la sélection des enzymes, la culture, la purification et d'autres aspects de la production à grande échelle. De plus, l'équipe technique derrière le développeur de Mira, Ampfuture, a passé près de 11 ans à perfectionner la technologie. Il est désormais entièrement équipé pour soutenir le développement de réactifs prêts à l'emploi, de développement personnalisé, de projets de recherche et d'autres services personnalisables.
Avantages:
1. Les protéines fonctionnelles dans les réactifs Mira proviennent de diverses enzymes, certaines enzymes subissant des modifications ciblées pour améliorer l'efficacité du système enzymatique central, résultant en un système plus complet.
2. Résistance et stabilité à une forte interférence. Les réactifs Mira subissent une optimisation étendue en termes de sélection et de concentration de cofacteurs, ainsi que des processus de production de lyophilisation, les rendant plus résistants aux interférences et plus stables.
3. Personnalisation et polyvalence. En raison du contrôle complet de la production de protéines fonctionnelles et d'une compréhension approfondie de la technologie, Mira peut être adaptée à diverses applications, offrant différents systèmes de réactifs et services de personnalisation personnalisés.
4. Brevets propriétaires. Étant donné que MIRA est développé à 100% au niveau national, il n'y a aucun risque de contrefaçon de brevet pendant le développement des produits. Cela donne à Mira un avantage concurrentiel à la fois sur les marchés nationaux et internationaux.
5. Un protocole de production complet a été établi, permettant une production stable à grande échelle.
Inconvénients:
1. La reconnaissance du marché est encore faible, et davantage de données et de références à partir de différents domaines (tels que des taux positifs dans différents domaines) sont nécessaires pour accepter une plus grande acceptation.
2. La conception d'amorces suit toujours les caractéristiques de RPA ou RAA, nécessitant des séquences d'amorces ou de sondes plus longues, ce qui peut ne pas faciliter un commutateur rapide pour les utilisateurs de PCR actuels.