Le contrôle réglable de l'activité Cas12 favorise une détection universelle et rapide des acides nucléiques en un seul pot.
Publié par : Université des sciences et technologies de Chine
Revue : Communications naturelles
Facteur d'impact : 14,7
Grâce à la technologie MIRA, une méthode universelle de détection d'acide nucléique fluorescent en un seul pot (SURVEY) basée sur l'héparine de sodium a été développée. Des études ont montré que l'héparine de sodium peut réguler l'activité de clivage de Cas12a en interférant avec le processus de liaison de l'ARNcr Cas12a-. En ajustant la concentration d'héparine sodique, SURVEY est compatible avec les séquences PAM classiques et sous-optimales et est applicable à plusieurs sous-types Cas12. Cette méthode, avec un temps de détection de seulement 15 -20 minutes, atteint une sensibilité et une spécificité supérieures à 95 % pour la détection du pseudovirus de la variole du singe, du virus de la grippe A et du SRAS-CoV-2. Il est peu coûteux et fournit une nouvelle méthode de détection au point d'intervention pour le diagnostic sur le terrain médical et la surveillance environnementale, abordant le difficile équilibre entre sensibilité et spécificité dans les diagnostics CRISPR traditionnels.
1. Etude sur le mécanisme d'action de l'héparine sodique
Une sonde fluorescente a été ajoutée au système Cas12a-crRNA contenant 10 nM d'ADN cible, et un signal fluorescent rapide et significatif a été observé sans ajout d'héparine de sodium. Lorsque 0,2 ug/ml d'héparine de sodium ont été ajoutés, le signal fluorescent était similaire à celui du groupe témoin, indiquant que l'héparine de sodium a fortement inhibé l'activité de clivage trans-de Cas12a. 0.2ug/mL d'héparine de sodium est la concentration minimale inhibitrice. À mesure que la concentration d'héparine de sodium augmente de 0,2 ug/mL à 0,5 ug/mL, l'activité de clivage cis-de Cas12a est progressivement inhibée, et à 0,5 ug/mL, l'activité de clivage trans-est presque complètement inhibée. Des études sur le mécanisme d'action de l'héparine de sodium ont montré que les groupes chargés négativement de l'héparine de sodium interfèrent avec la liaison correcte du crRNA à Cas12a et peuvent affecter la formation du complexe binaire crRNACas12a.
- MIRA-Détection mono-pot Cas12a-
Après avoir validé le mécanisme d'action de l'héparine de sodium, l'article a exploré une stratégie de détection-one-pot (MIRA-Cas12a), combinant l'amplification MIRA et la détection de fluorescence médiée par Cas12a-dans un seul tube.
En l'absence d'héparine de sodium, la combinaison MIRA-Cas12a n'a produit aucun signal de fluorescence significatif dans la plage de concentration du gène cible de 0,1 aM à 10 fM. À 40 µg/mL d'héparine de sodium, un signal de fluorescence significatif a été observé dans la plage de concentrations cibles de 1aM (≈0,6 copies/μL, volume=30μL) à 10fM (≈6 000 copies/μL, volume=30μL), démontrant une amélioration de plus de 10 000 fois de la sensibilité de détection par rapport à un système sans héparine de sodium.
La concentration de la matrice du virus Monkeypox était de 10 fM et l'ARNc Cas12a- (100 nM) a été utilisé pour détecter les gènes cibles f31 et b6r. La réaction d'amplification a été terminée à 0, 2, 4, 6, 8, 12, 16 et 20 minutes, et la teneur en produit d'amplification MIRA à différents moments a été analysée sur des gels d'agarose. Les produits résultants ont ensuite été analysés sur des gels d'agarose dans trois paramètres différents : MIRA-héparine sodique sans Cas12a, MIRA-Cas12a sans héparine sodique et MIRA-Cas12a avec héparine sodique. Les résultats ont montré qu'en l'absence d'héparine sodique, l'amplification de l'acide nucléique était gênée en raison de l'activité élevée de clivage cis- de Cas12a. Cependant, l'ajout d'héparine sodique a augmenté de manière significative l'amplification de l'acide nucléique en raison de la réduction de l'activité de clivage cis- de Cas12a.
L'article démontre qu'une méthode universelle de détection d'acide nucléique fluorescent (SURVEY) universelle basée sur l'héparine de sodium peut être obtenue en utilisant à la fois des séquences PAM classiques et des séquences PAM sous-optimales. De plus, outre LbCas12a, AsCas12a et AapCas12b sont également largement utilisés dans les méthodes CRISPR-Dx. Dans le système utilisant MIRA-AsCas12a, la fluorescence n'a été observée qu'en présence de 40 ug/mL d'héparine de sodium, indiquant qu'il peut détecter 1fM des gènes f31 et b6r. En l'absence d'héparine sodique, MIRA-AapCas12b peut détecter 1 gène f31 et b6r. L'administration de 20 ug/mL d'héparine sodique a non seulement accéléré le taux de détection de MIRA-AapCas12b, mais a également amélioré l'intensité de la fluorescence. Ces résultats indiquent que la méthode one-développée à l'aide d'un dosage d'héparine de sodium est également applicable à d'autres sous-types de Cas12.
