Staphylococcus haemolyticus est une bactérie à Gram-positive coagulase négative qui est très fréquente dans les hôpitaux. Ces dernières années, il y a eu une préoccupation croissante en raison du risque élevé d'infections acquises à l'hôpital. Staphylococcus haemolyticus peut provoquer davantage les infections cutanées, la méningite, la péritonite et même la septicémie. Les retards dans le diagnostic clinique peuvent entraîner une détérioration des problèmes de santé, donc le diagnostic rapide de Staphylococcus haemolyticus est essentiel pour un traitement précis.
Le groupe de recherche du professeur Ji Tuo du Département du laboratoire central de l'hôpital de Lianyungang Second People a publié un article "Une détection rapide et visuelle de Staphylococcus Haemolyticus dans des spécimens cliniques avec Mira-LFS" dans la revue "Analytica Chimica Acta", avec un facteur d'impact de 6,2.
Aperçu de l'étude
Dans cette étude, le groupe du professeur Ji Tuo a établi une méthode de détection de Staphylolyticus Haemolyticus par Mira-LFS basé sur le gène MVAA, et a utilisé la technologie d'amplification d'acide nucléique rapide à température constante multi-enzymatique, MiRA combinée avec une bande de test d'écoulement latérale pour obtenir une détection rapide de pathogènes pathogènes. L'expérience a été réalisée à 37 degrés et les résultats ont été détectés en 9 min avec une sensibilité de détection de 0. 147 CFU / réaction. La méthode de détection MIRA-LFS convient à la détection du point fixe de Staphylococcus haemolyticus dans les échantillons cliniques, et réalise la méthode d'identification de Staphylococcus hémolytique par POCT, qui est d'une grande valeur pour le diagnostic rapide et le traitement des maladies dans les zones sous-gérées. Le groupe de recherche a utilisé Mira-LFS, qPCR et des méthodes de culture bactérienne traditionnelles pour analyser 95 échantillons cliniques aléatoires et confirmé l'applicabilité clinique.
Méthodes de recherche
Un diagramme schématique du test MIRA-LFS est illustré ci-dessus. Dans cette étude, le kit d'amplification rapide à température constante de l'ADN de Biotech de l'ampfuture (type de test de test en or colloïdal) et la bande de test de détection de l'acide nucléique ont été utilisées.
La longueur d'amorce du gène MVAA était des nucléotides 30-35, et la longueur du produit d'amplification était 100-350 BP, et un total de 6 paires d'amorces candidates ont été conçues. La GDNA des souches staphylolytiques staphylolytiques standard a été utilisée pour l'analyse MIRA, les amorces candidates ont été dépistées et les produits amplifiés ont été visualisés par électrophorèse sur gel d'agarose à 2%.
(Les produits d'amplification sont affichés à l'aide d'électrophorèse sur gel d'agarose)
La sonde est ensuite conçue en fonction de la séquence d'amorce avant (16 pb vers l'arrière). L'extrémité 5 'de la sonde est étiquetée avec FITC et l'extrémité 3' est étiquetée C3. Le nucléotide de position 31- dans la sonde est remplacé par du THF à une distance de 30 pb de l'extrémité 5 'et de 15 pb de l'extrémité 3'. L'extrémité 5 'de l'amorce inverse sélectionnée est marquée avec de la biotine.
(Diagramme schématique de la modification de dimère et de séquence des combinaisons d'amorce-sondage)
De plus, les conditions de réaction pour la détection de MIRA-LFS par Staphylococcus hémolyticus ont été optimisées. Les tests sont effectués à 37 degrés de 4-12 min à 2 min intervalles. Les résultats sont présentés dans le temps de réaction de 8 minutes et la ligne de test est clairement visible. De plus, le test est effectué à partir de 22-52 de degré à des intervalles de 5 degrés. 37-42 Degré est la température la plus appropriée pour la détection Mira-LFS. Par conséquent, le temps de réaction optimal et la température de la méthode MIRA-LFS pour Staphylococcus hémolyticus étaient respectivement de 8 min et 37 degrés. Avec le fait que le résultat final est visualisé par LFS en 1 min, le temps de détection total est de 9 min.
(Optimisation du temps de réaction et de la température)
Résultats expérimentaux
1. Vérification de la sensibilité
Différentes concentrations d'ADN génomique (GDNA) obtenues à partir de dilutions série de Staphylococcus Haemolytica Cultures (1 0 ^ 6-10 ^ 0 CFU / ML) ont été testées pour Mira-LFS.
(Signal positif à différentes concentrations)
L'analyse de régression de l'unité probabiliste a montré que la LOD à 95% déterminée par le test MIRA-LFS était 0. 147cfu / réaction.
(Limite de calcul de détection)
2. Validation de la spécificité
La sélectivité de la détection MIRA-LFS a été déterminée en analysant 18 souches de micro-organismes pathogènes courants et 15 souches de Staphylococcus haemolyticus cliniques. Les résultats ont montré que le test MIRA-LFS était négatif pour les 18 autres bactéries pathogènes et positives pour 15 échantillons cliniques vérifiés de Staphylococcus hémolytique.
(8 souches de bactéries pathogènes standard et 15 souches de streptocoque hémolytiques cliniques ont été testées, respectivement)
Le test MIRA-LFS a une sélectivité élevée et convient au dépistage de Staphylococcus hémolytique.
3. Test d'échantillon réel
Un total de 95 échantillons ont été prélevés au hasard auprès de l'hôpital de Lianyungang Second People, dont 35 échantillons de peau et de tissus mous, 16 échantillons d'urine, 14 échantillons d'échantillons et 30 échantillons de sang.
(95 échantillons cliniques ont été testés par différentes méthodes)
Les résultats ont montré que la méthode de détection était cohérente à 100% avec la méthode qPCR. De plus, par rapport à l'étalon-or (GB / T4789. 11-2003), la sensibilité et la spécificité du test MIRA-LFS pour l'identification de l'infection de Staphylococcus hémolytica étaient respectivement de 100% et 98,73%. Ces résultats valident en outre la faisabilité technique de la méthode dans la détection de Staphylococcus hémolytique dans des échantillons cliniques.
La méthode Mira-LFS est utilisée pour la détection rapide de Staphylococcus hémolytique par POCT, qui est efficace, précise, simple et rentable, ce qui est utile pour le diagnostic rapide et les décisions de traitement.