Pour obtenir une amplification du signal pour des traces d'acides nucléiques viraux et fournir suffisamment de substrats pour Cas14a, nous avons développé aMIRA (amplification rapide isotherme multienzyme asymétrique) basée sur MIRA. Le système aMIRA-Cas14a qui en résulte offre les avantages clés suivants :
1. La stœchiométrie optimisée des amorces permet à MIRA de surproduire préférentiellement l’ADNsb, qui sert de substrat direct pour Cas14a. En ajustant le rapport d'amorce avant-à-inverse à 20 : 1, le système génère suffisamment d'ADNsb pour activer l'activité de clivage indépendante du PAM-de Cas14a, qui reconnaît et clive spécifiquement l'ADNss.
2. L'intégration unique de MIRA et CRISPR-Cas14a élimine les risques de contamination croisée.
3. MIRA améliore considérablement la sensibilité de détection, permettant la détection d'acides nucléiques viraux en très faible abondance.
4. aMIRA-Cas14a maintient une spécificité élevée, évitant les faux positifs causés par une amplification non spécifique.
En fin de compte, l'intégration unique de MIRA et CRISPR-Cas14a élimine les risques de contamination et permet d'obtenir une synergie parfaite entre les atouts de MIRA et le système CRISPR-Cas14a. Cela résout le problème de l’incompatibilité entre l’amplification isotherme et les systèmes CRISPR à l’échelle de l’industrie, ce qui représente la principale avancée technologique de la plate-forme MaC14a. Le système aMIRA-Cas14a permet d'obtenir une sensibilité 1 000 fois supérieure tout en garantissant une amplification spécifique. Combiné à la reconnaissance spécifique de la séquence de Cas14a, cela permet une validation de spécificité à double couche, sans réactivité croisée contre des virus non cibles ou des échantillons sains-résolvant un autre problème de l'industrie : la tendance aux faux positifs.
Les réactifs d'amplification rapide isotherme multienzyme MIRA utilisés dans cette étude ont été fournis par Amp‑Future (Changzhou) Biotech Co., Ltd. Au-delà des excellentes performances des réactifs, Amp‑future Biotech propose également une équipe d'assistance technique professionnelle et réactive.
MIRA démontre une forte compatibilité avec les puces microfluidiques basées sur des centrifugeuses-développées pour les applications de recherche et de diagnostic :
1. Système de réaction miniaturisé, adapté aux chambres de réaction à micro-volume caractéristiques des puces microfluidiques ;
2. Capacité de détection multiplex en une seule fois ;
3.Compatibilité avec les appareils portables, flux de travail fluides, de l'échantillon au résultat.
nous avons conçu un dispositif portable intégré de test de point de soins (POCT) "échantillon-entrée, réponse-sortie"-de-optimisé pour le déploiement sur le terrain, comme illustré dans la figure. 4A. Le prototype compact (23 cm (L) × 21 cm (L) × 14 cm (H), masse totale de 12,5 kg) offre une portabilité exceptionnelle. Les composants principaux du système comprennent un servomoteur de haute-précision pour un contrôle précis de la rotation et une unité de chauffage à air pour la régulation de la température. Un module de détection optique intégré, positionné sous la puce, facilite l'excitation et la mesure de la fluorescence, garantissant ainsi une sensibilité et une précision élevées de la détection. L'appareil portable est équipé d'un système d'exploitation Android intégré, offrant une interface conviviale-dans laquelle les opérateurs peuvent sélectionner des fichiers d'opération préprogrammés contenant des paramètres détaillés tels que le temps de réaction et la température. Les résultats et les conclusions sont affichés en-temps réel sur un écran LCD, permettant une acquisition rapide des informations. De plus, le système intègre un module de communication sans fil qui prend en charge la transmission de données-en temps réel vers des appareils mobiles ou des serveurs cloud, s'intégrant à des algorithmes d'intelligence artificielle pour une interprétation et une analyse immédiates des résultats des tests.
