Comment mesurer la polarisation de la fluorescence?

La polarisation de fluorescence (FP) est une technique puissante utilisée dans divers domaines, notamment la biochimie, la pharmacologie et les sciences de l'environnement. En tant que fournisseur de détecteur de fluorescence de premier plan, nous comprenons l'importance de mesures FP précises et fiables. Dans cet article de blog, nous explorerons comment mesurer la polarisation de la fluorescence, des principes de base aux considérations pratiques.

Principes de base de la polarisation de la fluorescence

La polarisation de fluorescence est basée sur le fait que lorsqu'une molécule fluorescente est excitée par la lumière polarisée, la lumière émise est également polarisée. Le degré de polarisation de la lumière émise dépend du mouvement de rotation de la molécule fluorescente pendant la durée de vie de la fluorescence. Si la molécule est grande ou liée à une macromolécule, son mouvement de rotation est restreint et la lumière émise reste très polarisée. Inversement, si la molécule est petite et libre en solution, son mouvement de rotation est rapide et la lumière émise devient dépolarisée.

La polarisation de la fluorescence est quantifiée par la valeur de polarisation (P), qui est définie comme la différence entre les intensités des composants polarisés verticalement et horizontalement de la lumière émise divisée par leur somme:

[P = \ frac {i _ {\ parallel} -i _ {\ perp}} {i _ {\ parallel} + i _ {\ perp}}]

où (i _ {\ parallel}) est l'intensité de la lumière émise verticalement polarisée, et (i _ {\ perp}) est l'intensité de la lumière émise polarisée horizontalement.

Instrumentation pour mesurer la polarisation de la fluorescence

Pour mesurer la polarisation de la fluorescence, vous avez besoin d'un détecteur de fluorescence équipé d'une optique de polarisation. Notre entreprise propose une gamme de détecteurs de fluorescence de haute qualité, y compris leDétecteur de fluorescence isothermeet leDétecteur de fluorescence isotherme numérique, qui sont spécialement conçus pour des mesures FP précises et sensibles.

Ces détecteurs se composent généralement des composants suivants:

1. Source légère: Une source lumineuse, comme une lampe au xénon ou un laser, est utilisée pour générer la lumière d'excitation. La lumière doit être polarisée avant d'atteindre l'échantillon.
2. Polariseurs: Les polariseurs sont utilisés pour contrôler la polarisation de la lumière d'excitation et d'émission. Le polariseur d'excitation est placé sur le chemin de la lumière d'excitation pour s'assurer qu'il est polarisé linéairement. Le polariseur d'émission est placé devant le détecteur pour mesurer les composants polarisés verticalement et horizontalement de la lumière émise.
3. Titulaire de l'échantillon: Un support d'échantillon est utilisé pour maintenir l'échantillon sur le chemin de la lumière d'excitation. Il doit être conçu pour minimiser la diffusion de la lumière et la fluorescence de fond.
4. Détecteur: Un photodétecteur, comme un tube de photomultiplier (PMT) ou un dispositif couplé de charge (CCD), est utilisé pour mesurer l'intensité de la lumière émise. Le détecteur devrait être en mesure de mesurer séparément les intensités des composants polarisés verticalement et horizontalement.

Configuration expérimentale pour les mesures de polarisation de fluorescence

Les étapes suivantes sont impliquées dans la mise en place d'une expérience pour mesurer la polarisation de la fluorescence:

1. Sélectionnez la sonde fluorescente appropriée: Choisissez une sonde fluorescente adaptée à votre application. La sonde doit avoir un rendement quantique élevé et une longue durée de vie de fluorescence.
2. Préparer l'échantillon: Préparez l'échantillon en dissolvant la sonde fluorescente dans un tampon approprié. Si vous étudiez une interaction de liaison, ajoutez le ligand ou la macromolécule à l'échantillon à la concentration appropriée.
3. Calibrez l'instrument: Calibrez le détecteur de fluorescence en fonction des instructions du fabricant. Cela peut impliquer d'ajuster le gain du détecteur, de régler les longueurs d'onde d'excitation et d'émission et de mesurer la fluorescence de fond.
4. Mesurer les valeurs de polarisation: Placer l'échantillon dans le porte-échantillon et mesurer les intensités des composants polarisés verticalement et horizontalement de la lumière émise. Calculez la valeur de polarisation en utilisant la formule mentionnée ci-dessus.

Facteurs affectant les mesures de polarisation de la fluorescence

Plusieurs facteurs peuvent affecter la précision et la fiabilité des mesures de polarisation de fluorescence:

1. Température: Le mouvement de rotation de la molécule fluorescente dépend de la température. Une augmentation de la température entraîne une augmentation du mouvement de rotation et une diminution de la valeur de polarisation. Par conséquent, il est important de maintenir une température constante pendant la mesure.
2. Viscosité du solvant: La viscosité du solvant affecte le mouvement de rotation de la molécule fluorescente. Un solvant plus visqueux restreint le mouvement de rotation et augmente la valeur de polarisation.
3. Concentration de la sonde fluorescente: La concentration de la sonde fluorescente peut affecter la valeur de polarisation. À des concentrations élevées, l'auto-extinction et l'agrégation de la sonde peuvent se produire, conduisant à des mesures inexactes.
4. Photoblanchiment: Le photoblanchi est la destruction irréversible de la molécule fluorescente par la lumière d'excitation. Cela peut entraîner une diminution de l'intensité de la fluorescence et affecter la mesure de polarisation. Pour minimiser le photoblanchiment, utilisez une lumière d'excitation à faible intensité et des temps d'exposition courts.

Applications de la polarisation de la fluorescence

La polarisation de fluorescence a un large éventail d'applications dans divers domaines:

1. Découverte de médicaments: FP est utilisé pour étudier les interactions de liaison entre les médicaments et leurs cibles. En mesurant la valeur de polarisation, vous pouvez déterminer l'affinité de liaison et la constante de dissociation du complexe de médicaments-cible.
2. Immunoessais: Les immunoessais basés sur FP sont utilisés pour détecter la présence d'antigènes ou d'anticorps dans des échantillons biologiques. La liaison de l'antigène à la sonde fluorescente marquée anticorps conduit à un changement de la valeur de polarisation, qui peut être utilisé pour quantifier l'analyte.
3. Analyse d'acide nucléique: FP peut être utilisé pour étudier l'hybridation des acides nucléiques. La liaison d'un oligonucléotide marqué par fluorescence à sa séquence complémentaire conduit à un changement de la valeur de polarisation, qui peut être utilisé pour détecter et quantifier l'acide nucléique cible.

Dépannage des mesures de polarisation de la fluorescence

Si vous rencontrez des problèmes lors des mesures de polarisation de fluorescence, les conseils de dépannage suivants peuvent être utiles:

1. Valeurs de polarisation faibles: Si les valeurs de polarisation sont plus faibles que prévu, vérifiez des facteurs tels que la température élevée, la faible viscosité du solvant ou une concentration élevée de la sonde fluorescente.
2. Fluorescence de fond élevé: Une fluorescence de fond élevée peut être causée par des impuretés dans l'échantillon ou le solvant, ou par la diffusion de la lumière. Purifiez l'échantillon et utilisez un solvant propre. Assurez-vous que le support d'échantillon est propre et exempt de rayures.
3. Mesures incohérentes: Des mesures incohérentes peuvent être dues à un photoblanchiment, un mauvais alignement des polariseurs ou des fluctuations dans la source lumineuse. Minimisez le photoblanchiment, vérifiez l'alignement des polariseurs et assurez-vous que la source lumineuse est stable.

Conclusion

La mesure de la polarisation de fluorescence est une technique précieuse pour étudier les interactions de liaison et la dynamique moléculaire des molécules fluorescentes. En tant que fournisseur de détecteur de fluorescence, nous nous engageons à fournir une instrumentation de haute qualité et un support technique pour vous aider à obtenir des mesures de FP précises et fiables. Que vous travailliez dans la découverte de médicaments, les immunoessais ou l'analyse de l'acide nucléique, notreDétecteur de fluorescence isothermeetDétecteur de fluorescence isotherme numériquepeut répondre à vos besoins.

Si vous êtes intéressé à acheter nos détecteurs de fluorescence ou à avoir des questions sur les mesures de polarisation de fluorescence, veuillez nous contacter pour une consultation détaillée et une négociation d'approvisionnement. Notre équipe d'experts est prête à vous aider à sélectionner l'instrument le plus approprié pour votre demande.

Références

1. Lakowicz, Jr (2006). Principes de la spectroscopie de fluorescence. Springer Science & Business Media.
2. Szollosi, J. et Damjanovich, S. (2004). Polarisation de fluorescence: un guide pratique. Dans les protocoles actuels de la cytométrie (pp. 1 - 17). John Wiley & Sons, Inc.